中國科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室海洋微生物代謝工程與生物合成研究團隊在海洋微生物氧雜蒽酮生物合成機制研究中取得新進展，相關(guān)成果于2022年9月14日在線發(fā)表于Nature Communications（《自然·通訊》）。
包含氧雜蒽酮骨架的天然產(chǎn)物具有抗炎、抗氧化、抑菌及抗腫瘤等多種活性。自四十多年前首次報道氧雜蒽酮類化合物以來，該類部分化合物已成為藥物研發(fā)的明星分子，如被FDA批準(zhǔn)用于治療口腔潰瘍的藥物amlexanox、用于治療肺纖維化的先導(dǎo)藥物xantholipin以及廣譜的抗球蟲藥物simaomicin α。目前已發(fā)展了較多關(guān)于氧雜蒽酮類化合物的化學(xué)合成方法，但放線菌來源化合物的氧雜蒽酮骨架的生物合成過程和酶學(xué)機制仍不清楚。
研究團隊早期從海洋小單孢菌SCSIO N60中發(fā)現(xiàn)了Fluostatin C (7)，與kinamycin A (11)同屬苯并芴類非典型角環(huán)素。前期研究闡明fluostatin生物合成途徑中的黃素氧化酶FlsO2具有雙功能，能夠催化氧化和脫水反應(yīng)，將8形成9（圖1）。但奇怪的是基因缺失突變株？flsO2中仍可觀察到少量的化合物9，暗示基因簇中的其他氧化酶可能互補FlsO2的體內(nèi)功能（Org. Lett., 2015, 17, 5324）。kinamycins生物合成研究表明單加氧酶AlpJ（FlsG同源蛋白）催化9的縮環(huán)反應(yīng)形成苯并芴中間體12，黃素氧化酶AlpK可能負(fù)責(zé)12的C-5位羥化形成13。團隊的前期體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)AlpK的同源酶FlsO1具有類似的C-5位羥化功能（J. Org. Chem., 2021, 86, 11019）（圖1），但因化合物12不穩(wěn)定而無法獲得，從而限制了FlsO1的體外功能研究。然而有趣的是，團隊近期獲得了nenestatin A生物合成中間體nenestatin C (14)（Org. Biomol. Chem., 2021,19, 4243），其結(jié)構(gòu)與12類似，可作為12的模擬底物進行FlsO1的體外功能研究（圖1）。
基于上述科學(xué)問題研究人員發(fā)現(xiàn)黃素氧化酶FlsO1能夠體外催化多元氧化反應(yīng)，一方面確實可以催化前體8形成產(chǎn)物9，從而回補FlsO2的生理功能，另一方面還可以將8轉(zhuǎn)化為多個產(chǎn)物，包括氧雜蒽酮化合物16和17（圖1）。此外，研究人員通過同位素標(biāo)記、中間體或其衍生物的結(jié)構(gòu)鑒定等實驗闡明了FlsO1通過催化三步級聯(lián)氧化反應(yīng)（羥化、環(huán)氧化和Baeyer-Villiger氧化）形成氧雜蒽酮的反應(yīng)機理（圖2）；同時發(fā)現(xiàn)FlsO1還能夠催化完成14（模擬生理底物12）的C-5羥基化，間接證明了FlsO1的生理功能；通過FlsO1酶的晶體結(jié)構(gòu)、關(guān)鍵中間體的docking分析和氨基酸殘基定點突變實驗揭示了FlsO1接受不同底物，催化多元氧化反應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了海洋放線菌中顯著不同于真菌和植物中氧雜蒽酮環(huán)的生物合成機制，闡明了多功能黃素氧化酶FlsO1催化多元氧化反應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，拓展了黃素蛋白功能研究的視野，為氧雜蒽酮的結(jié)構(gòu)多樣化和構(gòu)效關(guān)系研究提供了新的工具酶和研究手段。
中國科學(xué)院南海海洋研究所楊春芳副研究員和張麗萍副研究員為本文共同第一作者，張長生研究員為本文通訊作者。本研究得到了國家自然科學(xué)基金委項目、海南省重大科技計劃項目、國家重點研發(fā)計劃項目、王寬誠教育基金項目、中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進會、廣東省海洋經(jīng)濟發(fā)展專項資金項目和南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室（廣州）人才團隊引進重大專項等資助。
相關(guān)論文信息：Chunfang Yang#, Liping Zhang#, Wenjun Zhang, Chunshuai Huang, Yiguang Zhu, Xiaodong Jiang, Wei Liu, Mengran Zhao, Bidhan Chandra De, and Changsheng Zhang*, Biochemical and structural insights of multifunctional flavin-dependent monooxygenase FlsO1-catalyzed unexpected xanthone formation. Nature Communications 2022, 13, 5386. doi.org/10.1038/s41467-022-33131-0
圖1 多功能氧化酶FlsO1的生理功能和意外發(fā)現(xiàn)的新功能
圖2 FlsO1催化氧雜蒽酮環(huán)形成的酶學(xué)機制
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