北京時間3月18日，中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所婁春波課題組與北京大學(xué)物理學(xué)院定量生物學(xué)中心歐陽頎/錢瓏團隊合作在Nature Communications上發(fā)表精準(zhǔn)控制哺乳動物細胞多個基因表達劑量的人工基因線路，題為“Precise programming of multigene expression stoichiometry in mammalian cells by a modular and programmable transcriptional system”。該工作通過在哺乳動物構(gòu)建人工正交轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，實現(xiàn)了單個和多個啟動子轉(zhuǎn)錄活性的精準(zhǔn)微調(diào)，構(gòu)建了具有預(yù)測能力的多基因表達量的定量熱力學(xué)模型，并將這個定量模型應(yīng)用于甲型流感病毒（H1N1）病毒樣顆粒（VLP）組分與產(chǎn)量的優(yōu)化設(shè)計。秦宸睿、項延會和劉杰為共同第一作者，中科院深圳先進院婁春波和北京大學(xué)錢瓏為文章共同通訊作者。
文章上線截圖
在哺乳動物細胞中，精確調(diào)控基因線路對于細胞適應(yīng)環(huán)境、穩(wěn)態(tài)維持和發(fā)育分化等生理功能至關(guān)重要。關(guān)鍵基因表達量過量或不足都可能導(dǎo)致癌癥等重要疾病。此外，多個細胞命運決定因子表達劑量也是重塑細胞命運分化和發(fā)育的關(guān)鍵因素。然而，在哺乳動物細胞中，基因表達受到多種復(fù)雜因素的影響，例如：基因順序、基因組位置、表觀遺傳修飾和宿主細胞類型等，使得精確控制基因表達劑量變得非常困難。比如說，常用的啟動子EF1α的轉(zhuǎn)錄活性在HEK293T等七個細胞系中受到細胞類型的顯著影響；而CMV強啟動子在運動神經(jīng)元細胞中的表達活性會出現(xiàn)起始活性很高而隨后逐漸減弱的情況。因此，模塊化、不受細胞類型影響且可編程的基因表達系統(tǒng)成為哺乳動物細胞生物學(xué)和合成生物學(xué)研究中的重要瓶頸問題。
本文提出一種設(shè)計策略，旨在開發(fā)一種模塊化、獨立于宿主的正交型轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。該正交型轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由正交型啟動子庫和單體RNA聚合酶（RNAP）組成。該系統(tǒng)通過將RNA加帽酶與單體RNAP融合，可確保原核來源的單體RNAP在哺乳動物細胞中按照“跨域（domain）”方式實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、出核和翻譯等真核系統(tǒng)蛋白質(zhì)表達的必需步驟（圖1）。
本論文發(fā)現(xiàn)了不同基因表達活性的競爭效應(yīng)，并建立了定量的熱力學(xué)模型。針對兩個基因的競爭問題，研究團隊設(shè)計了一個哺乳動物細胞系中的兩個報告基因（圖2）。在這個雙報告基因體系中，每個報告基因由正交型啟動子庫中的七個代表性啟動子之一控制，共有49種不同的組合。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個基因的強啟動子顯著降低了另一個基因的表達。這個結(jié)果證明了兩個報告基因在競爭有限資源（ [RNAP]free）。因此，本論文提出了利用[RNAP]free取代的[RNAP]tot的新型熱力學(xué)方程式（圖2e）。
在哺乳動物細胞中，多個基因的先后順序也會顯著影響基因表達量。為了研究基因先后順序?qū)虮磉_量的影響，研究團隊設(shè)計了三個報告基因的六種可能的先后順序（1-2-3， 1-3-2， 2-1-3， 2-3-1， 3-1-2， 3-2-1），并計算了報告基因在所有六種組合中的表達量的方差 (圖3)。作者們發(fā)現(xiàn)同一啟動子的表達量的方差系數(shù)(CV) 非常小。這個結(jié)果表明啟動子活性不受其局部基因環(huán)境的顯著影響，而且在CHO和HEK293T細胞株中都保持類似行為。另外，研究團隊在50個啟動子庫中，針對三個不同報告基因任意選擇其啟動子（活性變化100倍左右）。通過修正的熱力學(xué)模型，文章預(yù)測了三種報告基因的活性。根據(jù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)哺乳動物細胞中的三個基因的蛋白表達量都可以由模型預(yù)測（R2=0.81~0.88）。
為證實正交轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的優(yōu)勢，研究團隊使用定量熱力學(xué)模型優(yōu)化了病毒樣顆粒的多個亞基的基因表達劑量。病毒樣顆粒（VLP）是由多個蛋白質(zhì)組成的無病原性并且不能進行復(fù)制的納米顆粒。在疫苗和藥物傳遞等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。多個蛋白亞基的表達水平對于VLP的組裝效率和免疫原性至關(guān)重要。因此，團隊研究了表達水平的可編程性以及它對VLP產(chǎn)量的影響。首先，作者們驗證了在適當(dāng)?shù)谋磉_劑量條件下，甲型流感病毒的三個關(guān)鍵亞單位（血凝素（HA）、神經(jīng)氨酸酶（NA）和基質(zhì)蛋白1（M1））可以形成穩(wěn)定的VLP。然后，構(gòu)建了兩個融合基因（egfp-M1和NA-mCherry），用于定量表征VLP的產(chǎn)量和完整度。接著，使用修正后的定量熱力學(xué)模型預(yù)測了所有預(yù)設(shè)啟動子參數(shù)和基因特異性參數(shù)的VLP產(chǎn)量（共157,464個組）。通過虛擬篩選和理論分析，研究團隊發(fā)現(xiàn)HA基因的高表達對產(chǎn)生VLP有害，而適當(dāng)表達的三個基因則可以產(chǎn)生更多的VLP顆粒。最后，團隊選擇了十余組高產(chǎn)組合進行實驗驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有組合都產(chǎn)生了更多的VLP顆粒，并且實驗結(jié)果與預(yù)測值相符，其中預(yù)測值越高實驗結(jié)果越好。
綜上所述，本研究開發(fā)了一種模塊化、可編程的正交型轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)。此外，該研究還建立了基于胞內(nèi)資源競爭和結(jié)合能的定量熱力學(xué)理論模型，可以實現(xiàn)對哺乳動物細胞中多個基因表達劑量的精確設(shè)計和預(yù)測。通過利用這種正交型轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，研究團隊還成功地優(yōu)化了甲型流感病毒病毒樣顆粒（VLP），為新型高效甲型流感疫苗的開發(fā)和生產(chǎn)提供了潛力。
該工作得到了國家重點研發(fā)計劃項目，國家自然科學(xué)基金，中科院先導(dǎo)計劃、青年交叉團隊項目和深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院的資助。
圖1. 正交型啟動子庫和跨物種通用轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的構(gòu)建和定量模型的實驗驗證
圖2. 哺乳動物細胞內(nèi)關(guān)鍵因子的共享造成多個啟動子活性的競爭效應(yīng)和相關(guān)定量熱力學(xué)模型
圖3. 基因先后順序?qū)φ恍娃D(zhuǎn)錄系統(tǒng)的影響很小，及相關(guān)定量熱力學(xué)模型的預(yù)測性
圖4. 甲型流感病毒的病毒樣顆粒（VLP）的三個亞基基因的表達劑量的可預(yù)測優(yōu)化與實驗驗證
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