近日，中國科學(xué)院南海海洋研究所張長(cháng)生研究員團隊在抗性基因介導海洋微生物天然產(chǎn)物結構多樣化研究中獲得新進(jìn)展。研究揭示了糖苷酶KijX水解海洋微生物天然產(chǎn)物L(fēng)obophorin（LOBs）中的糖基側鏈，從而介導菌株對LOBs產(chǎn)生抗性的新機制，闡明了異源重組菌株中LOBs的結構多樣化是內源基因和外源基因簇間相互作用的結果，為抗生素耐藥性和結構多樣化研究提供了新思路。相關(guān)研究成果“A Widespread Glycosidase Confers Lobophorin Resistance and Host-Dependent Structural Diversity”發(fā)表于A(yíng)ngewandte Chemie International Edition (《德國應用化學(xué)》)，并被遴選為”Hot Paper"。

　　抗生素耐藥問(wèn)題正在引發(fā)全球健康危機，普遍認為耐藥性的產(chǎn)生與抗生素的廣泛使用息息相關(guān)。但越來(lái)越多的研究發(fā)現，即使在人跡罕至的凍土和洞穴中發(fā)現的微生物中也存在抗生素抗性基因，表明環(huán)境微生物作為抗性基因的儲存庫，可能是臨床耐藥菌株中抗性因子的起源。這也提出了一個(gè)關(guān)于抗生素與其抗性基因演化過(guò)程中“先有雞還是先有蛋”的有趣問(wèn)題：是抗生素的廣泛使用催生了抗性基因的進(jìn)化，還是抗性基因本已古老存在，只是因抗生素的使用而加速了其發(fā)現過(guò)程？無(wú)論如何，從環(huán)境微生物中鑒別新的抗生素抗性基因，理解其生態(tài)功能，可以為抗生素的臨床耐藥性提供潛在的可控措施和解決方案。

　　LOBs屬于螺環(huán)乙酰乙酸內酯類(lèi)抗生素，研究人員前期從海洋來(lái)源鏈霉菌Streptomyces sp. SCSIO 01127中分離到LOBs A/B，解析了LOBs生物合成中負責糖基化（LobG1、LobG2和LobG3）（Org Lett, 2013, 15, 1374-1377; Org Lett, 2020, 22, 1062-1066）、糖甲基化（LobS1）（Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97, 3885-3892）和C-32羥化（LobP1）（Chin J Chem, 2023, 41, 1478-1484）等后修飾酶的功能（圖1）。但在近期研究中發(fā)現一個(gè)特別的現象：與野生型菌株產(chǎn)物不同，異源重組菌株S. coelicolor M1154/pCSG5560（含有lob基因簇）中產(chǎn)生了一系列C-9位帶單糖且C-32位為羥甲基的LOBs，而意外的是，雖然LobP1體外反應確證其負責C-9位帶三糖或雙糖的LOBs的C-32位甲基羥化，但LobP1卻不能催化C-9位帶有單糖的LOBs發(fā)生羥化（圖1）。由此產(chǎn)生了異源重組菌株中這些C-9位帶單糖且C-32位為羥甲基的LOBs是如何產(chǎn)生的問(wèn)題。

　　基于上述問(wèn)題，通過(guò)文獻調研和生物轉化實(shí)驗，研究人員在異源宿主中發(fā)現了一個(gè)糖苷酶KijX，可催化LOBs中C-9位多糖鏈的水解，但不能催化C-9位帶單糖的LOBs發(fā)生糖基水解（圖1）。在異源重組菌株S. coelicolor M1154/pCSG5560中，LOBs的合成經(jīng)歷了LobG1（C-17糖基化），LobG3（C-9位連續添加兩個(gè)糖）和LobG2（C-9位的第三個(gè)糖）催化的糖基化，KijX催化的C-9位三糖（或雙糖）產(chǎn)物脫糖，LobG3催化的C-9位重新糖基化（單糖）的復雜過(guò)程（圖2）。通過(guò)外源基因簇lob和內源基因kijX之間相互作用，最終實(shí)現了LOBs的結構多樣化。

　　

圖2.野生型菌株和異源重組菌株中LOBs產(chǎn)生的差異及菌株對LOBs產(chǎn)生抗性的分子機制

　　進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析發(fā)現，KijX的同源酶在細菌、真菌和古菌中廣泛存在。查詢(xún)到細菌來(lái)源KijX蛋白2323個(gè)，真核生物來(lái)源68個(gè)，古菌來(lái)源9個(gè)。體外酶學(xué)實(shí)驗顯示，在選取的56個(gè)不同來(lái)源的KijX同源蛋白（相似性28？91%）中51個(gè)有水解糖基的活性，部分同源蛋白的活性?xún)?yōu)于KijX。由于KijX同源蛋白廣泛存在于放線(xiàn)菌門(mén)中，推測該酶可能為放線(xiàn)菌對抗環(huán)境中LOBs的一種抗性機制。活性評價(jià)實(shí)驗顯示C-9位帶有單糖或無(wú)糖的LOBs對放線(xiàn)菌指示菌株沒(méi)有抑制活性；C-9位帶有三糖或雙糖的LOBs能夠抑制不含kijX及同源酶基因的放線(xiàn)菌的生長(cháng)。導入kijX基因后，敏感菌株對LOBs產(chǎn)生抗性。相反，C-9位帶有三糖或雙糖的LOBs不能抑制含有kijX及同源基因的放線(xiàn)菌的生長(cháng)，但敲除kijX及同源基因后，菌株對LOBs敏感（圖3）。這些實(shí)驗證實(shí)了kijX及其同源基因為L(cháng)OBs的抗性基因。菌株間的拮抗實(shí)驗顯示同樣的結果，表明菌株通過(guò)產(chǎn)生LOBs來(lái)抑制同一生境中其他微生物的生長(cháng)以獲得競爭優(yōu)勢，體現了環(huán)境微生物間的一種共進(jìn)化關(guān)系（圖3）。

圖3. kijX作為抗性基因的鑒定以及LOBs產(chǎn)生菌和非產(chǎn)生菌之間的拮抗作用

　　為了進(jìn)一步闡明這類(lèi)特殊糖苷酶的作用機制，研究人員解析了AcvX（KijX同源蛋白）的晶體結構。與AlphaFold2預測的15個(gè)其他KijX同源蛋白結構比較顯示，這類(lèi)酶含有典型的GH113家族糖基水解酶的（β/α）8桶狀結構，但與典型GH113家族水解酶相比，KijX及其同源酶與底物結合的口袋呈現出特征的帶負電的凹槽，這個(gè)負電凹槽是該類(lèi)酶特異性對LOBs產(chǎn)生水解作用的關(guān)鍵結構特征。進(jìn)一步通過(guò)晶體疊加和點(diǎn)突變分析找到了該類(lèi)蛋白可能的催化位點(diǎn)，并推測了其催化機制。

　　絕大多數KijX同源酶在本研究之前被注釋為未知功能蛋白，含有kijX的微生物在環(huán)境中分布非常廣泛，涵蓋了沙漠、海洋和深洞，以及人體和動(dòng)物的腸道微生物。與此相反，含有LOB生物合成基因簇的微生物大多數來(lái)自于海洋環(huán)境。由此推測某些抗生素的抗性基因本已古老存在，抗生素的廣泛使用加速了其發(fā)現過(guò)程。kijX及其同源基因作為L(cháng)OBs的抗性基因是巧合還是必然，是否其進(jìn)化的目的是為抵抗環(huán)境中的LOBs均還未知，它們的原始生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步研究。

　　譚彬博士、張麗萍副研究員和張慶波研究員為本文共同第一作者，朱義廣和張長(cháng)生研究員為共同通訊作者。該研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目、國家自然科學(xué)基金重大項目、廣東省海洋經(jīng)濟發(fā)展(海洋六大產(chǎn)業(yè))專(zhuān)項資金項目、海南省重大科技計劃項目和中國科學(xué)院王寬誠率先人才計劃“盧嘉錫國際團隊項目”等資助。

　　相關(guān)論文信息：

　　A Widespread Glycosidase Confers Lobophorin Resistance and Host-Dependent Structural Diversity. https://doi.org/10.1002/anie.202302043