近日，中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)課題組在基因蛋白表達(dá)水平的雙向定量調(diào)控領(lǐng)域取得了重要突破。相關(guān)成果以“Precise genome editing of the Kozak sequence enables bidirectional and quantitative modulation of protein translation to anticipated levels without affecting transcription”為題在線發(fā)表于Nucleic Acids Research（核酸研究）雜志。該研究以蛋白翻譯調(diào)控元件—Kozak序列為切入點(diǎn)，開發(fā)出一種全新的、普適的策略，用于精細(xì)調(diào)控目標(biāo)基因蛋白表達(dá)水平。這種策略在不觸及基因轉(zhuǎn)錄的情況下，既能實(shí)現(xiàn)蛋白表達(dá)水平的雙向（上調(diào)或下調(diào)）調(diào)控，又能將蛋白表達(dá)水平控制在預(yù)測(cè)范圍內(nèi)。

　　基因的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)過程，其表達(dá)水平的調(diào)控可以在多個(gè)層面上進(jìn)行，包括基因組、轉(zhuǎn)錄、翻譯等層面。過去的研究已經(jīng)對(duì)調(diào)控基因表達(dá)進(jìn)行了大量探索，并取得了許多重要的進(jìn)展。例如，通過使用基因編輯工具對(duì)基因序列進(jìn)行編輯，引入移碼突變或破壞起始密碼子等，可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的完全敲除；利用組成型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子，可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的過量表達(dá)；利用RNA干擾技術(shù)或CRISPR/Cas9激活或抑制系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的激活或抑制。然而，這些策略只能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的完全敲除或?qū)⒛繕?biāo)基因的表達(dá)量調(diào)控到不可預(yù)測(cè)的水平，而不能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的可預(yù)測(cè)定量調(diào)控。

　　在真核細(xì)胞的mRNA中，非翻譯區(qū)（Untranslated Region，UTR）存在調(diào)控基因翻譯的元件，如Kozak序列、上游開放閱讀框（Upstream Open Reading Frame, uORF)等。有課題組針對(duì)uORF進(jìn)行設(shè)計(jì)，建立了精細(xì)上調(diào)或下調(diào)內(nèi)源基因翻譯的方法，并成功應(yīng)用到植物分子設(shè)計(jì)育種領(lǐng)域。但該策略無法定量地將蛋白表達(dá)控制在特定水平。Kozak序列是翻譯起始附近的序列，對(duì)于核糖體正確識(shí)別翻譯起始密碼子具有直接關(guān)系，其序列的不同，會(huì)導(dǎo)致蛋白合成量的差異，這提示了通過改造基因Kozak序列可能獲得不同翻譯效率的調(diào)控效果。

　　因此，該研究基于對(duì)編碼基因Kozak序列的精確操作，提出了一種名為KZ3-edit的新型基因表達(dá)調(diào)控策略：利用精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)在DNA水平上精確修飾起始密碼子上游的3個(gè)核苷酸（這是Kozak序列的一部分，堿基偏好最顯著，被命名為KZ3），這足以高效調(diào)控基因的翻譯效率。在不改變基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)序列的情況下，對(duì)mRNA的翻譯水平進(jìn)行定量和雙向調(diào)控，從而將蛋白表達(dá)精細(xì)地控制在預(yù)期的水平。通過體外雙熒光報(bào)告系統(tǒng)、綠色熒光細(xì)胞系及內(nèi)源基因三個(gè)層面，研究人員驗(yàn)證了KZ3-edit策略的有效性和靈活性，并證實(shí)通過精準(zhǔn)基因編輯工具對(duì)基因主效開放閱讀框（Primary Open Reading Frame, pORF）或uORF起始密碼子上游KZ3序列的單個(gè)堿基改變或堿基組合轉(zhuǎn)變，可以實(shí)現(xiàn)特定基因翻譯水平的高效調(diào)控。

　　此外，研究人員還將該策略應(yīng)用于家兔生物性狀的調(diào)控，分別以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的PCSK9基因和調(diào)控毛發(fā)生長(zhǎng)周期的HR基因?yàn)榘谢颉Ｒ环矫妫ㄟ^改變PCSK9基因的pORF的KZ3序列來直接降低PCSK9蛋白表達(dá)量，成功構(gòu)建了低膽固醇家兔模型；另一方面，通過修飾HR基因的uORF—U2HR，改變其KZ3序列而間接上調(diào)HR基因的蛋白表達(dá)量，成功構(gòu)建了遺傳性少毛癥家兔模型。這兩種家兔模型的成功構(gòu)建為KZ3-edit策略在基因的精細(xì)調(diào)控中的應(yīng)用，以獲得目標(biāo)生物性狀提供了范例。

　　該研究提出了一種普適、高效、靈活的基因翻譯調(diào)控新策略，可以對(duì)目標(biāo)基因起始密碼子前三個(gè)堿基進(jìn)行直接基因編輯，從而實(shí)現(xiàn)雙向定量調(diào)控目標(biāo)基因翻譯水平的效果。這種策略理論上可以應(yīng)用于真核生物所有的編碼基因，且該策略調(diào)控翻譯的有效性、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便性以及應(yīng)用多樣性將為基因功能研究、人類遺傳疾病模型構(gòu)建與治療、農(nóng)業(yè)精準(zhǔn)分子設(shè)計(jì)育種等提供重要的技術(shù)手段。

　　本研究中，廣州健康院謝精科副研究員、莊鎮(zhèn)鵬博士和茍士學(xué)博士為共同第一作者，王可品研究員和賴良學(xué)研究員為共同通訊作者。該研究成果得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、海南省科技計(jì)劃、廣東省科技計(jì)劃、中國(guó)科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)等項(xiàng)目的資助。

       論文鏈接

KZ3-edit策略原理圖