9月26日，中國科學院深圳先進技術(shù)研究院合成生物學研究所Howard Chou團隊在Metabolic Engineering上發(fā)表了題為Combinatorial optimization and spatial remodeling of CYPs to control product profile的研究成果。在該研究中，研究人員通過組合優(yōu)化策略，在釀酒酵母中成功構(gòu)建了細胞色素P450氧化酶(CYP)和細胞色素P450氧化酶還原酶(CPR)的氧化網(wǎng)絡，實現(xiàn)特定三萜皂苷quillaic acid（QA）的高效生物合成。

　　QA是多種皂樹皂苷的苷元，而皂樹皂苷已經(jīng)被開發(fā)成多種疫苗的佐劑。本研究通過迭代篩選氧化還原庫中的CYP-CPR組合，解決了從 -amyrin（BA）到QA生物合成過程中三個不同位點上六步氧化反應的平衡問題；并通過工程化改造釀酒酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和減小不同CYP間的空間距離，進一步提高了CYP網(wǎng)絡的氧化效率。在多達47個潛在氧化產(chǎn)物的產(chǎn)物譜中，QA的比例達到86%，產(chǎn)量達到2.23 g/L。該研究所提出的CYP氧化網(wǎng)絡概念為調(diào)控多種CYP參與的復雜氧化通路生物合成提供了新的思路，并為控制產(chǎn)物的專一性提供了新的方法。 

　　以QS-21、QS-7、QS-17為代表的皂樹皂苷已經(jīng)作為天然免疫佐劑被廣泛應用于帶狀孢疹、瘧疾、和Covid-19等疫苗中。而在皂樹中發(fā)現(xiàn)的58種三萜皂苷中，有49種皂苷的苷元為QA。構(gòu)建高產(chǎn)QA的酵母細胞工廠可以為高效生物合成QS-21等天然免疫佐劑奠定基礎。在QA的生物合成中，需要將BA的C-16、C-23、和C-28分別氧化為羥基、醛基、和羧基。高效生物合成QA需要實現(xiàn)這三個位點的氧化平衡，否則會出現(xiàn)46種過氧化或不完全氧化的副產(chǎn)物（圖一），而過多的副產(chǎn)物不僅降低目標化合物產(chǎn)量，也增加純化成本。 

　　在本研究中，研究人員首先構(gòu)建了可以生產(chǎn)BA的底盤菌株，并利用該底盤篩選了12個不同的CYP以確定最優(yōu)的候選基因用于QA的生物合成。實驗發(fā)現(xiàn)CYP716A12在氧化BA的C-28生成Oleanolic acid (OA)時效率最高，CYP716A262氧化OA生成EA時的效率最高，CYP714E19主要氧化OA生成C-23羥基產(chǎn)物hederagenin（HE），而CYP72A567主要氧化OA生成C-23醛基產(chǎn)物gypsogenin （GY）和C-23羧基產(chǎn)物gypsogenic acid（GA）。前期文獻報道CYP716A262可以直接將BA的C-16和C-28分別氧化成羥基和羧基得到echinocystic acid（EA）。有別于傳統(tǒng)代謝工程思路去增強CYP716A262基因的表達，本研究通過迭代篩選CYP發(fā)現(xiàn)了CYP氧化的網(wǎng)絡效應。相較于同時表達CYP716A262和CYP716A12，表達兩個拷貝的CYP716A262的EA產(chǎn)量要低32.9%（圖三）。 

　　研究人員隨后考察了CPR對CYP網(wǎng)絡的影響。在考察了不同的CYP-CPR組合后，發(fā)現(xiàn)CPR不僅對氧化產(chǎn)物的產(chǎn)量產(chǎn)生影響，并會改變產(chǎn)物譜中不同產(chǎn)物的比例（圖二）。研究人員同時發(fā)現(xiàn)在表達植物的CYP時，來源自動物或者真菌的CPR有時比植物的CPR能夠更好的提高目標化合物的產(chǎn)量和比例。CPR篩選實驗發(fā)現(xiàn)CrCPR與CYP716A12組合時效果最好。通過在BA高產(chǎn)底盤中表達CrCPR、CYP716A12、CYP716A262、和CYP72A567到了菌株yQA11。搖瓶發(fā)酵其QA的產(chǎn)量僅為21.3 mg/L，并且有大量的前體OA和EA積累。此外通過迭代篩選也發(fā)現(xiàn)，SaCPR與CYP716A262和CYP72A567的組合較佳。 

　　雖然強化代謝流通量是提高產(chǎn)量的有效手段，但是研究人員發(fā)現(xiàn)過表達釀酒酵母內(nèi)源的erg1只能增加雙位點的氧化產(chǎn)物如EA和HE的產(chǎn)量積累，并不能增加QA的產(chǎn)量，從而證明單純增加前體供應對于三位點氧化產(chǎn)物的積累影響較小（圖三）。 

　　研究人員隨后通過再次迭代篩選候選CYP和CPR，發(fā)現(xiàn)表達兩個拷貝的CYP72A567和一個拷貝的CYP714E19時QA的產(chǎn)量要高于表達三個拷貝的CYP72A567（圖四），再一次證明了CYP氧化的網(wǎng)絡效應存在。而在CYP網(wǎng)絡中引入能與CYP72A567和CYP716A262更好組合的SaCPR，也可以進一步提高QA的產(chǎn)量。通過在菌株yQA11中再增加一個拷貝的CYP72A567，并引入CYP714E19和SaCPR得到菌株yQA12P，QA的產(chǎn)量增加了350%，達到95.9 mg/L。 

　　研究人員隨后發(fā)現(xiàn)在CYP網(wǎng)絡中引入來自擬南芥的MSBP1能夠降低不同CYP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的空間距離，并減少因底物擴散導致的中間體積累，從而將QA的產(chǎn)量從95.9 mg/L提高到172 mg/L（圖五）。最后通過增加輔因子NADPH的供給和過表達酵母內(nèi)源基因ice2以增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的空間面積，QA的產(chǎn)量達到258 mg/L。通過在1 L的發(fā)酵罐中進行分批補料發(fā)酵，QA的產(chǎn)量達到2.23 g/L（圖六），比前期報道的產(chǎn)量高7倍。 

　　該論文的第一作者是楊加增助理研究員，Howard Chou正高級工程師為本文的通訊作者。羅小舟研究員和Jay Keasling教授也為本研究提供了資源支持，并在實驗設計和論文寫作上提供了指導。 這項工作得到了國家重點研發(fā)計劃（2020YFA0907700），國家自然科學基金（22050410274和32101183）、比爾及梅琳達 蓋茨基金會（INV-025841）、廣東省基礎與應用基礎研究基金（2021B1515020049和2023A1515011338）、中國博士后基金（2020M682988）和深圳合成生物學創(chuàng)新研究院的支持。 

圖五：減小CYP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的空間距離提高QA產(chǎn)量