近期，中國科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗室（LMB）/廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗室（LMM）閆巖研究員團隊完成了對真菌來(lái)源的quadrane新骨架倍半萜terrecyclic acid的生物合成研究，成果發(fā)表在英國皇家化學(xué)會(huì )旗艦期刊《Chemical Science》上，文章被該刊評為每周亮點(diǎn)論文和2024熱點(diǎn)論文。

倍半萜是萜類(lèi)化合物中占比最多的一種，分子中含15個(gè)碳原子，由三個(gè)異戊二烯單元組成鏈狀、環(huán)狀等多種骨架結構，分布于植物、昆蟲(chóng)、微生物等生物中，具有廣泛的生物活性，是醫藥、食品和化妝品研發(fā)的重要源泉。Terrecyclic acid是一類(lèi)由環(huán)戊烷駢雙環(huán)辛烷組合而成的quadrane倍半萜骨架，經(jīng)過(guò)氧化后修飾而成的一類(lèi)具有抗菌、抗腫瘤活性天然產(chǎn)物。該類(lèi)化合物最早發(fā)現于土曲霉，后又相繼從不同來(lái)源的真菌和柳珊瑚中發(fā)現（如圖1）。

圖1?來(lái)自真菌（A）和柳珊瑚（B）的天然quadrane倍半萜

由于quadrane骨架的特殊結構與良好的生物學(xué)活性，其制備方法的研究受到廣泛關(guān)注，其中合成化學(xué)家先后開(kāi)發(fā)出20余條合成路線(xiàn)。然而由于該類(lèi)化合物特殊的結構和成環(huán)方式，使得其化學(xué)合成步驟多，產(chǎn)率較低，在一定程度阻礙了先導藥物的開(kāi)發(fā)。通過(guò)合成生物學(xué)方法大量制備quadrane類(lèi)天然產(chǎn)物，是解決這一問(wèn)題的有效策略。同位素示蹤實(shí)驗表明，quadrane骨架的生物合成可能經(jīng)歷了兩種完全不同的途徑，即Hirota途徑和Coates途徑。盡管計算化學(xué)研究表明后者的可能性更高，但quadrane骨架的生物合成基因與其形成的確切酶學(xué)機制仍有待證實(shí)（路徑圖1）。

路徑圖1?推測的?β-terrecyclene形成途徑. (A) Hirota途徑?(藍色)和Coates分別由FPP生成的β-terrecyclene。(B) Coates重排形成的 α-terrecyclene。

閆巖研究員團隊通過(guò)對真菌基因組的挖掘，發(fā)現了該類(lèi)化合物的生物合成基因簇ter，包括一個(gè)萜類(lèi)環(huán)化酶（terpene cyclase，TC）即terA、一個(gè)P450氧化基因（terB）、一個(gè)短鏈脫氫基因（terC）和一個(gè)主要協(xié)同轉運因子超家族基因（terD），如圖2A。通過(guò)異源表達、體內喂養、體外酶反應等研究，驗證了基因簇中各基因的功能（圖2B-2E），證實(shí)了其生物合成途徑：即在環(huán)化酶TerA的作用下催化FPP產(chǎn)生化合物25，進(jìn)而產(chǎn)物25被P450酶TerB羥化和羧基化產(chǎn)生化合物32，最后32被脫氫酶TerC催化形成終產(chǎn)物2，如圖2F。

圖2?抗腫瘤倍半萜terrecyclic acid的生物合成途徑解析?（A）Terrecyclic acid的生物合成基因簇；（B）蛋白TerA在酵母S. cerevisae中的異源表達（i）和體外反應（ii）；（C）基因簇ter在A(yíng). nidulans中的異源表達：（i）A. nidulans的空白對照，（ii）基因terAB在A(yíng). nidulans中的異源表達，ii）基因terABC在A(yíng). nidulans中的異源表達；（D）蛋白TerC的體外反應：（i）蛋白TerC將底物32轉化為2，（ii）煮沸過(guò)的TerC對底物32失活，（iii）蛋白TerC對底物33無(wú)反應；（E）蛋白TerB的體外反應：（i）微粒體蛋白TerB可以催化底物25轉化為32，（ii）蛋白TerB和TerC可以將25轉化為2；（F）Terrecyclic acid (2)的生物合成途徑。

在發(fā)現新型倍半萜環(huán)化酶（β-terrecyclene合酶，TerA）可以催化法尼基焦磷酸（FPP）轉化為β-terrecyclene（25）的基礎上，通過(guò)對TerA的系列定點(diǎn)突變研究（圖3），結合動(dòng)力學(xué)同位素效應分析（圖4），確證了環(huán)化過(guò)程為Coates途徑，而非最早提出的Hirota途徑。

圖3?基因terA的點(diǎn)突變、產(chǎn)物及其機制

圖4?突變株TerA-V114A的動(dòng)力學(xué)同位素效應 (A) 通過(guò) [12-2H3]-FPP 的動(dòng)力學(xué)同位素效應區分Hirota和Coates途徑. (B) FPP和[12-2H3]-FPP 為底物比較TerA-V114A產(chǎn)物的動(dòng)力學(xué)同位素效應。

通過(guò)以上研究，作者發(fā)現了抗菌、抗腫瘤quadrane骨架倍半萜terrecyclic acid的生物合成基因簇，以此為基礎，解析了其通過(guò)β-terrecyclene環(huán)化酶TerA形成quadrane骨架，繼而氧化、脫氫的后修飾的生物合成過(guò)程。Quadrane骨架的形成機制也通過(guò)對蛋白TerA的點(diǎn)突變和動(dòng)力學(xué)同位素效應得以證實(shí)，從而解決了幾十年來(lái)關(guān)于該類(lèi)天然產(chǎn)物生物合成研究的謎團。該研究也為進(jìn)一步以萜類(lèi)環(huán)化酶TerA為探針，從真菌數據庫中對quadrane類(lèi)天然產(chǎn)物的發(fā)掘奠定了基礎。

以上研究，副研究員宋永相為第一作者，研究員閆巖為通訊作者。由濟南大學(xué)的王文貴博士，美國加州大學(xué)洛杉磯分校（UCLA）唐奕（Yi Tang）教授團隊合作完成。

上述研究工作得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計劃、海南省科技計劃三亞崖州灣科技城科技創(chuàng )新聯(lián)合項目、國家自然科學(xué)基金、中國科學(xué)院王寬誠率先人才計劃“盧嘉錫國際團隊項目”和海南省自然科學(xué)基金、廣東特支計劃?“海洋藥物研究開(kāi)發(fā)創(chuàng )新團隊”等的資助。

Chemical Science作為英國皇家化學(xué)會(huì )資助的旗艦期刊，對各國研究人員在化學(xué)領(lǐng)域取得的突破性成果，經(jīng)評審接收后免費發(fā)表，并對全球讀者開(kāi)放獲取。文章接收后，被Chemical Science評為每周亮點(diǎn)論文（2024 ChemSci Pick of the Week Collection）和2024熱點(diǎn)論文（2024 Chemical Science HOT Article Collection）。

本文鏈接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2024/sc/d4sc01208a。

文章相關(guān)信息：Yongxiang Song,Wengui Wang,Jiafan Yang,De-Wei Gao,John M Billingsley,Songtao Wang,Yiguang Zhu,Junfeng Wang,Jianhua Ju,Yan Yan* and Yi Tang. Chem. Sci.,2024,doi.org/10.1039/D4SC01208A