近日，中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)/王可品課題組在Signal Transduction and Targeted Therapy雜志上發(fā)表了題為In vivo evaluation of guide-free Cas9-induced safety risks in a pig model的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)，Cas9蛋白本身在豬體內(nèi)持續(xù)性表達(dá)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)基因組損傷、轉(zhuǎn)錄組穩(wěn)態(tài)改變和全基因組突變?cè)黾樱瑥亩l(fā)安全風(fēng)險(xiǎn)。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)由Cas9蛋白和單鏈導(dǎo)向RNA（sgRNA）組成，因其強(qiáng)大的基因組改造能力而備受關(guān)注。CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于基因功能研究、人類疾病模型構(gòu)建、作物和家畜生產(chǎn)性能改良等。此外，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因治療已被應(yīng)用于治療各種遺傳性疾病或其他難治性疾病的臨床試驗(yàn)中，特別是首款CRISPR/Cas9基因治療藥物的批準(zhǔn)上市，標(biāo)志著CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)跨越實(shí)驗(yàn)室的門檻，正式步入臨床應(yīng)用的新紀(jì)元。

盡管臨床試驗(yàn)結(jié)果振奮人心，但CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因治療仍存在重大的安全性風(fēng)險(xiǎn)，包括脫靶、基因組損傷和潛在的免疫原性等。sgRNA依賴的脫靶和基因組損傷已引起了廣泛關(guān)注，并開發(fā)出多種新型基因編輯方法來減低以上風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生。然而，有報(bào)道顯示Cas9蛋白作為外源蛋白，也可以誘發(fā)基因組損傷，激活p53相關(guān)通路并富集p53失活突變，引發(fā)CRISPR/Cas9系統(tǒng)臨床應(yīng)用的額外安全性擔(dān)憂。目前，對(duì)Cas9蛋白本身導(dǎo)致的安全性風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估僅限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，而對(duì)于在體基因治療，亟需在體評(píng)估Cas9蛋白導(dǎo)致的安全性風(fēng)險(xiǎn)。

豬在器官大小、解剖結(jié)構(gòu)、生理代謝、免疫系統(tǒng)等方面與人非常相似，被認(rèn)為是評(píng)估基因治療有效性和安全性的理想大動(dòng)物模型。前期，賴良學(xué)課題組培育出了小分子藥物靈活調(diào)控基因剪刀蛋白Cas9表達(dá)的工具豬。利用該工具豬，小分子藥物可靈活調(diào)控Cas9蛋白在豬體內(nèi)的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)劑量，極大方便了在大動(dòng)物體內(nèi)評(píng)估Cas9蛋白單獨(dú)表達(dá)導(dǎo)致的安全性風(fēng)險(xiǎn)。

研究人員首先證實(shí)，Cas9蛋白在豬體內(nèi)單獨(dú)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)胞DNA雙鏈斷裂，引起基因組損傷，并且這種損傷程度與Cas9蛋白的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)劑量呈正相關(guān)。接著，研究人員進(jìn)一步證實(shí)，Cas9蛋白短期（2周）持續(xù)體內(nèi)表達(dá)還可導(dǎo)致多器官轉(zhuǎn)錄組穩(wěn)態(tài)改變，包括凋亡、細(xì)胞周期阻滯、DNA損傷修復(fù)等相關(guān)信號(hào)通路基因的激活。更為重要的是，隨著Cas9在豬體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)（5個(gè)月到12個(gè)月），模型豬出現(xiàn)了生長(zhǎng)遲緩和消化功能障礙等異常表型，全基因組測(cè)序分析顯示，長(zhǎng)期表達(dá)Cas9蛋白的豬體內(nèi)基因組突變數(shù)量顯著增加，并且腫瘤驅(qū)動(dòng)基因突變數(shù)量同樣高于對(duì)照組，表明Cas9蛋白的長(zhǎng)期表達(dá)不僅影響個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育，還可能增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

該研究在大動(dòng)物體內(nèi)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了Cas9蛋白的上述新安全風(fēng)險(xiǎn)，提示我們?cè)趹?yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行基因治療時(shí)，還需要充分考慮來源于Cas9蛋白本身潛在的安全隱患。

中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院葛維凱博士、茍士學(xué)博士，趙筱竹博士研究生和金琴副研究員為該論文的共同第一作者，王可品研究員、賴良學(xué)研究員和吳涵副研究員為該論文的共同通訊作者。該研究成果得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院院外創(chuàng)新單元、海南省重大科技計(jì)劃、中國(guó)科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)等項(xiàng)目的資助。

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豬體內(nèi)單獨(dú)表達(dá)Cas9蛋白引發(fā)的安全性風(fēng)險(xiǎn)示意圖