新型雙堿基編輯器AGBE工作原理圖。課題組 供圖

　　近日，中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院研究員賴良學(xué)課題組在新型堿基編輯器開發(fā)方面取得重要進(jìn)展，獲得了可同時(shí)兼具當(dāng)前多種單堿基編輯器及CRISPR/Cas9基因編輯功能的多功能堿基編輯器，可廣泛地誘導(dǎo)產(chǎn)生多種模式的突變，對于飽和突變文庫構(gòu)建、基因突變功能研究等方面具有重要促進(jìn)作用。相關(guān)研究在線發(fā)表于《核酸研究》（Nucleic Acids Research）。

　　基因單核苷酸變異（SNV）與基因功能密切相關(guān)。基于日漸普及的高通量測序技術(shù)，研究人員在動(dòng)植物乃至人類基因組中發(fā)現(xiàn)了大量的SNVs。這些細(xì)微的基因差異中的部分已經(jīng)被證實(shí)與動(dòng)植物的性狀變異相關(guān)，也與人類遺傳疾病的發(fā)生發(fā)展或藥物療效存在密切聯(lián)系。但是目前仍有大量SNV的功能尚未得到明確，如何揭示這些遺傳變異與物種性狀及臨床表型間的關(guān)聯(lián)，是農(nóng)業(yè)分子育種和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域向前推進(jìn)時(shí)亟需解決的瓶頸。

　　基因飽和突變文庫是研究基因SNV功能的重要工具。利用基因編輯技術(shù)在基因特定區(qū)域中引入不同類型的堿基突變，并以其為基礎(chǔ)進(jìn)行功能性篩選，可以實(shí)現(xiàn)基因SNV功能的高通量研究。

　　近年來，基因突變文庫構(gòu)建主要借助CRISPR/Cas9系統(tǒng)在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)引入移碼突變破壞基因表達(dá)，從而根據(jù)表型鑒定基因功能。這種方式也可以誘導(dǎo)基因SNV的產(chǎn)生，但是效率極其低下，不適合用于與基因SNVs相關(guān)的飽和突變文庫的高效構(gòu)建。David Liu實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的堿基編輯器（BE）為飽和文庫的構(gòu)建帶來了技術(shù)上的突破。BE系統(tǒng)可以在基因特定區(qū)域引入高效的單堿基轉(zhuǎn)換，因此被迅速應(yīng)用于與DNA損傷應(yīng)答或癌癥相關(guān)的基因SNVs功能的高通量篩選等研究中，并取得了突破性的成果。但現(xiàn)有的BE只能實(shí)現(xiàn)一種或兩種類型的堿基轉(zhuǎn)換，不能滿足飽和突變文庫對編輯產(chǎn)物多樣性的需求，因此，亟需建立可以誘導(dǎo)多種類型堿基轉(zhuǎn)換的基因編輯工具。

　　該研究將腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和糖苷酶堿基編輯器（CGBE）結(jié)合，開發(fā)出一種新型的雙堿基編輯器——AGBE。它可以利用單個(gè)向?qū)NA（sgRNA）誘導(dǎo)同一等位基因的靶序列單獨(dú)或同時(shí)發(fā)生包括A-to-G、C-to-G、C-to-T和C-to-A等4種不同類型的堿基轉(zhuǎn)換。隨后，研究人員在永生化細(xì)胞系、原代細(xì)胞和胚胎細(xì)胞等多個(gè)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞體系中驗(yàn)證了AGBE系統(tǒng)的有效性。結(jié)果表明，與單獨(dú)的ABE和CGBE相比，AGBE極大地拓寬編輯窗口（從4-8到3-13），在此基礎(chǔ)上通過將不同類型的堿基轉(zhuǎn)換進(jìn)行組合，可以大幅度地增加編輯產(chǎn)物的多樣性，從而構(gòu)建出含有更多基因突變類型的突變文庫。令人驚喜的是，研究人員通過分析全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)AGBE并不會(huì)引起明顯的DNA或RNA水平的脫靶效應(yīng)，證明了該系統(tǒng)是一款高效且安全的堿基編輯工具。

　　研究人員挑選了人類白喉毒素受體基因hDTR用于驗(yàn)證AGBE在基因飽和突變文庫構(gòu)建中的應(yīng)用潛能。當(dāng)hDTR基因發(fā)生突變時(shí)，會(huì)改變?nèi)祟惣?xì)胞對白喉毒素的敏感性，結(jié)合白喉毒素篩選和富集，可以快速獲得具有白喉毒素抗性的突變文庫，從而分析hDTR基因的SNV與藥物敏感性間的聯(lián)系。研究結(jié)果表明，在針對hDTR基因的關(guān)鍵功能域設(shè)計(jì)的32條sgRNA中，有20條可以賦予細(xì)胞抵抗白喉毒素的能力，產(chǎn)生了多達(dá)59269種不同類型的等位基因突變產(chǎn)物，并從中篩選出對白喉毒素有不同敏感性的突變細(xì)胞株。以上結(jié)果充分證實(shí)了利用AGBE系統(tǒng)進(jìn)行基因SNVs功能高通量研究的可行性和高效性。

　　在本項(xiàng)研究中，賴良學(xué)課題組梁艷慧博士、謝精科博士、張全軍助理研究員和王曉民博士為該論文共同第一作者，賴良學(xué)研究員和王可品副研究員為共同通訊作者。該研究工作得到了國家自然科學(xué)基金、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、廣東省科技計(jì)劃、中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)和中國科協(xié)青年人才托舉工程等項(xiàng)目的資助。

　　相關(guān)論文信息：https://doi.org/10.1093/nar/gkac353