9月12日，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院李漢杰課題組聯(lián)合深圳市寶安區婦幼保健院、深圳大學(xué)、上海交通大學(xué)和復旦大學(xué)等單位在《細胞》（Cell）期刊上發(fā)表了題為An immune cell atlas reveals the dynamics of human macrophage specification during prenatal development 的文章。研究團隊結合單細胞轉錄組測序、先進(jìn)的生物信息學(xué)手段、多重免疫熒光染色、體外功能實(shí)驗等技術(shù)構建了橫跨18個(gè)發(fā)育階段、19種組織的人類(lèi)胚胎免疫系統發(fā)育高分辨率圖譜。研究團隊重點(diǎn)關(guān)注了最具組織特異性的巨噬細胞，鑒定了15種巨噬細胞亞型，其中包括兩種新的巨噬細胞亞型，即存在于表皮、睪丸、心臟等外周組織的類(lèi)小膠質(zhì)細胞（Microglia-like cells）和具有血管生成促進(jìn)功能并廣泛分布于多個(gè)組織中的促血管生成巨噬細胞（Proangiogenic macrophages, PraM）。該研究通過(guò)構建人類(lèi)產(chǎn)前免疫細胞發(fā)育的時(shí)空動(dòng)態(tài)圖譜，揭示了多種巨噬細胞亞型在發(fā)育過(guò)程中的分化起源、空間定位、功能特征及轉錄調控機制。
研究團隊對來(lái)自受孕后4-26 PCW（Postconceptional Week，PCW）囊括19種人類(lèi)胚胎組織樣本的免疫細胞進(jìn)行了單細胞轉錄組測序，獲得了近30萬(wàn)個(gè)高質(zhì)量的免疫細胞(圖1)，并鑒定了11種主要的免疫細胞類(lèi)型，包括：巨噬細胞（Macrophages）、祖細胞（Progenitor cells）、B 淋巴細胞、T 淋巴細胞、先天淋巴細胞（Innate-like lymphocytes）、自然殺傷細胞（Natural killer cells）、樹(shù)突狀細胞（Dendritic cells）、單核細胞（Monocytes）、巨核細胞（Megakaryocytes）、粒細胞（Granulocytes）和紅細胞（Erythrocytes）。在此基礎之上，研究團隊對每一種主要的免疫細胞類(lèi)型進(jìn)行了更細致的分類(lèi)，最終注釋得到56種免疫細胞亞型。
研究人員重點(diǎn)對巨噬細胞進(jìn)行了研究并將其進(jìn)一步細分為了15個(gè)亞群。通過(guò)時(shí)空分析，他們發(fā)現在人類(lèi)胚胎發(fā)育時(shí)期，巨噬細胞就已經(jīng)具有了顯著(zhù)的組織特異性。在4 PCW左右（器官初形成階段），巨噬細胞前體就已經(jīng)出現在胚胎以及卵黃囊中并一直持續到大概8 PCW，直到被成熟的組織駐留巨噬細胞所替代。在這些巨噬細胞中，一部分亞型具有顯著(zhù)的組織特異性特征，如中樞神經(jīng)系統中的小膠質(zhì)細胞，肝臟中的枯否細胞、表皮中的朗格漢斯細胞等。而另外一部分亞型共享于多個(gè)組織中，如促血管生成巨噬細胞以及其前體細胞（pre-Proangiogenic macrophages, pre-PraM）。研究團隊還發(fā)現腎上腺中有一群特有的組織駐留巨噬細胞（AXL+, FCGR3A+），睪丸中也存在一群特有的組織駐留巨噬細胞（MMP9+）和一群具有破骨細胞特征的巨噬細胞（ACP9+, SIGLEC15+, MMP9+）。
在本研究中，研究人員首次在胚胎多個(gè)外周組織（皮膚、心臟及睪丸）中鑒定出一群和小膠質(zhì)細胞有相似基因表達譜特征的巨噬細胞。這一發(fā)現打破小膠質(zhì)細胞只存在于腦及脊髓中的傳統認知。這群細胞高表達P2RY12, TMEM119, SALL1, C3等和小膠質(zhì)細胞相同的特征基因，并且在無(wú)監督聚類(lèi)分析中，這群細胞也和腦、脊髓中的小膠質(zhì)細胞聚為一類(lèi)。研究人員因此將這群新發(fā)現的分布在多個(gè)外周組織的細胞命名為類(lèi)小膠質(zhì)細胞（Microglia-like cells）。流式分析進(jìn)一步驗證了這群外周組織中的類(lèi)小膠質(zhì)細胞與中樞神經(jīng)系統中的小膠質(zhì)細胞一樣，都呈現CD45lowP2RY12+MRC1-的表型。此外，基于多重免疫熒光實(shí)驗，發(fā)現類(lèi)小膠質(zhì)細胞在Carnegie Stages 12（CS12）時(shí)期就已經(jīng)出現在表皮組織中。在14 PCW之前，類(lèi)小膠質(zhì)細胞一直是表皮中最主要的免疫細胞，此后細胞比例才開(kāi)始逐漸減少，在20 PCW之后，基本被朗格漢斯細胞替代。在胚胎心臟中，類(lèi)小膠質(zhì)細胞最早出現在CS13的主動(dòng)脈（aorta）中，并且在26 PCW之前一直是主動(dòng)脈中最主要的免疫細胞。而成人主動(dòng)脈組織中則檢測不到這群類(lèi)小膠質(zhì)細胞。在胚胎睪丸中，類(lèi)小膠質(zhì)細胞最早能夠在CS14的時(shí)候被檢測到，主要存在于附睪（epididymis）中的輸出小管（efferent duct）周?chē)诓G丸實(shí)質(zhì)（parenchyma）中比例則較低。
表皮和中樞神經(jīng)系統均起源于外胚層，而主動(dòng)脈和附睪則起源于主動(dòng)脈-性腺-中腎（aorta-gonad-mesonephros, AGM）區域。研究團隊推測，小膠質(zhì)細胞以及類(lèi)小膠質(zhì)細胞的前體從卵黃囊遷移到外胚層和 AGM 區域，隨后在這兩個(gè)區域獨立分化為小膠質(zhì)細胞或類(lèi)小膠質(zhì)細胞。
由于類(lèi)小膠質(zhì)細胞在表皮中最為豐富，研究團隊進(jìn)一步研究了它們在表皮組織中的功能。研究團隊發(fā)現，與四肢和腹部皮膚相比，類(lèi)小膠質(zhì)細胞在背部和頭部表皮中比例更高。在9 PCW時(shí)，背部表皮中幾乎所有的免疫細胞都是類(lèi)小膠質(zhì)細胞，而四肢表皮中約60%的免疫細胞是類(lèi)小膠質(zhì)細胞。進(jìn)一步定量分析表明，在胚胎發(fā)育不同階段，背部表皮的類(lèi)小膠質(zhì)細胞都比四肢表皮更多，分布更密集。
類(lèi)小膠質(zhì)細胞在表皮中的極化分布模式與神經(jīng)嵴細胞（neural crest cells， NCCs）的背外側遷移路線(xiàn)（dorsolateral migration）有類(lèi)似之處，因此研究人員猜測表皮的類(lèi)小膠質(zhì)細胞與NCCs之間可能存在某種互作。NCCs是外胚層衍生的多能干細胞，背外側遷移時(shí)可分化為黑色素細胞（melanocytes）。通過(guò)多重免疫熒光實(shí)驗，研究團隊發(fā)現表皮中的類(lèi)小膠質(zhì)細胞和NCCs之間存在直接的相互作用。與之一致的是，研究團隊觀(guān)察到類(lèi)小膠質(zhì)細胞和黑色素母細胞（melanoblasts）的密度在不同發(fā)育階段沿表皮的背-側-腹軸（dorsal-lateral-ventral axis）逐漸降低。
為了評估類(lèi)小膠質(zhì)細胞對神經(jīng)嵴細胞分化的影響，研究團隊體外培養了來(lái)源于胚胎背部的新鮮皮膚組織塊。在胚胎皮膚中清除類(lèi)小膠質(zhì)細胞顯著(zhù)減少了黑色素母細胞的數量，這提示了類(lèi)小膠質(zhì)細胞可能會(huì )調控神經(jīng)嵴細胞向黑色素細胞的分化。
研究團隊在多個(gè)臟器中都鑒定到了一群高表達促血管生成基因（VEGFA, TNF, IL1B, CXCL8/IL8）的巨噬細胞，并且這群細胞在不同組織中都具有相似的基因表達譜。體外成管實(shí)驗也證實(shí)了這群細胞促血管生成的功能。他們進(jìn)一步分析發(fā)現，這群細胞在各個(gè)臟器中都富集在血管周?chē)?/span>
研究團隊又進(jìn)一步分析了這群促血管生成巨噬細胞的發(fā)育起源。通過(guò)多種擬時(shí)序分析算法推斷這群細胞是從卵黃囊起源的巨噬細胞前體分化而來(lái)，并且中間經(jīng)歷了一個(gè)相對不成熟的前體狀態(tài)（pre-PraM）。擬時(shí)序分析推算出的分化軌跡與細胞的真實(shí)采樣時(shí)間高度一致，并且其促血管生成信號也在隨之增強。此外，研究團隊用成管的內皮細胞上清液培養來(lái)源于卵黃囊的早期巨噬細胞前體，發(fā)現可以誘導出表達促血管生成基因的巨噬細胞。這些結果明確了這群促血管生成巨噬細胞的發(fā)育起源。
總而言之，該研究通過(guò)對人類(lèi)產(chǎn)前階段近30萬(wàn)個(gè)免疫細胞的單細胞轉錄組分析，著(zhù)重描繪了15種巨噬細胞亞型的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化。突破性的發(fā)現了一群在轉錄組、特征蛋白表達、和形態(tài)上與中樞神經(jīng)系統中的小膠質(zhì)細胞類(lèi)似且存在于皮膚、睪丸和心臟中的類(lèi)小膠質(zhì)細胞。它們是早期表皮中的主要免疫細胞群，沿背-側-腹軸呈極化分布。這群類(lèi)小膠質(zhì)細胞可以與神經(jīng)嵴細胞相互作用，并調節其向黑色素細胞的分化。通過(guò)功能、空間特征、分化軌跡的研究，研究團隊還細致解析了一種尚未被充分了解的促血管生成巨噬細胞，它們駐留在多個(gè)器官的血管周?chē)＿@些促血管生成巨噬細胞與小膠質(zhì)細胞均從起源于卵黃囊的巨噬細胞前體分化而來(lái)（圖2）。該文章為研究人類(lèi)巨噬細胞的異質(zhì)性和發(fā)育提供了一個(gè)高分辨率的時(shí)空動(dòng)態(tài)圖譜，有助于理解其在發(fā)育過(guò)程中的不同作用。研究團隊還開(kāi)發(fā)了一個(gè)專(zhuān)門(mén)的可視化平臺（http://119.8.233.169/），方便共享數據，促進(jìn)研究成果的共同探索和領(lǐng)域發(fā)展。
中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院李漢杰研究員、深圳市寶安區婦幼保健院朱元方教授、深圳大學(xué)總醫院吳雪清教授、上海交通大學(xué)醫學(xué)院Florent Ginhoux教授、復旦大學(xué)代謝與整合生物學(xué)研究院青年研究員王冠琳博士為本文共同通訊作者。中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院王澤帥（華中農業(yè)大學(xué)博士研究生）、吳志生（東南大學(xué)博士研究生）、研究助理馮若輕；深圳市寶安區婦幼保健院母胎醫學(xué)研究所陳曉燕博士、王昊博士；復旦大學(xué)代謝與整合生物學(xué)研究院青年研究員王冠琳博士，廈門(mén)大學(xué)博士研究生李沐曦、以色列魏茨曼研究所王雙寅博士為文章共同第一作者。
圖1 構建人類(lèi)免疫系統發(fā)育時(shí)空圖譜
圖2 巨噬細胞前體分化為小膠質(zhì)細胞/類(lèi)小膠質(zhì)細胞和促血管生成巨噬細胞；類(lèi)小膠質(zhì)細胞在表皮與神經(jīng)嵴細胞互作，并調控其分化
圖3 孫悟空猴毛變出多種猴子的情節寓意卵黃囊來(lái)源的巨噬細胞前體向不同細胞亞群的分化
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