4月13日，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院司同課題組在國際學(xué)術(shù)期刊ACS Catalysis在線(xiàn)發(fā)表研究論文“RhlA Exhibits Dual Thioesterase and Acyltransferase Activities during Rhamnolipid Biosynthesis”。鼠李糖脂（Rhamnolipid，RL）是一種最具應用潛力的生物表面活性劑。RhlA酶是影響RL產(chǎn)物結構的關(guān)鍵因素，但其序列-結構-功能關(guān)系尚不清楚，且催化機制存在爭議。研究團隊依托深圳合成生物研究重大科技基礎設施，首次解析了RhlA的蛋白質(zhì)晶體結構，意外的發(fā)現游離3-羥基脂肪酸可以作為RL生物合成過(guò)程的中間體，證實(shí)了RhlA具有雙重硫酸酯酶和酰基轉移酶活性。通過(guò)結合半理性設計與高通量質(zhì)譜篩選，團隊獲得了底物選擇性顯著(zhù)改變的RhlA突變體，這一研究為未來(lái)鼠李糖脂產(chǎn)品高效、特異性工業(yè)化生產(chǎn)提供機制基礎和技術(shù)借鑒。本文的第一作者是課題組助理研究員唐婷博士，通訊作者為司同研究員和張建志助理研究員。  

文章上線(xiàn)截圖 

文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.3c00046 

　　生物表面活性劑是由動(dòng)植物和微生物生成的表面活性分子；相較于化學(xué)合成表面活性劑，它們的結構更加多樣，并且具有良好的環(huán)境兼容性。因此，生物表面活性劑可以作為洗滌劑、乳化劑、潤濕劑、發(fā)泡劑和分散劑等重要化工產(chǎn)品的綠色替代原料。鼠李糖脂具有顯著(zhù)降低流動(dòng)相間表/界面張力的能力，且具有優(yōu)異的起泡、乳化和絮凝作用，同時(shí)具備穩定性、低毒性和生物可降解性等優(yōu)點(diǎn)。因此，在石油、環(huán)境、農業(yè)、食品和醫藥等領(lǐng)域具有廣泛的應用前景。美國Jeneil公司研制的生物基鼠李糖脂產(chǎn)品于2004年榮獲美國聯(lián)邦環(huán)保署頒發(fā)的“總統綠色化學(xué)挑戰獎”。 

　　盡管如此，鼠李糖脂的大規模應用仍受制于高昂的生產(chǎn)成本，其中約70%為分離成本；一個(gè)重要原因是生物合成的鼠李糖脂中存在大量結構相似、難以分離的同系物。深入研究和改造鼠李糖脂生物合成途徑，有助于實(shí)現目標同系物的高效特異性生產(chǎn)，從而降低分離成本，促進(jìn)工業(yè)生產(chǎn)和市場(chǎng)推廣，實(shí)現對合成表面活性劑的綠色替代。 

　　RhlA是影響RL分子結構多樣的關(guān)鍵因素。RhlA催化合成RL的疏水模塊——3-羥基烷酰基-3-羥基烷酸（HAA），該酶的底物選擇性決定了疏水模塊中脂肪鏈的長(cháng)度和不飽和度，進(jìn)而影響RL的理化性質(zhì)和生物活性。然而，由于實(shí)驗手段的限制，RhlA底物選擇性的機制解析和工程改造尚處于起步階段。例如，迄今為止尚無(wú)RhlA蛋白質(zhì)晶體結構的報道，而同源結構建模指導下的半理性設計未能有效改變RhlA底物選擇性。另外，鼠李糖脂同系物之間僅存在精細的分子結構差異，定性和定量分析需要依賴(lài)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法，其較低的分析速度（30分鐘/樣品）也限制了定向進(jìn)化策略的應用。 

　　為克服這些局限，本研究通過(guò)X射線(xiàn)晶體學(xué)方法首次解析了銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)來(lái)源RhlA的蛋白質(zhì)結構，揭示了RhlA具有α/β水解酶折疊結構。出乎意料的是，除Ser-His-Asp催化中心附近經(jīng)典的配體結合口袋1外，研究人員還發(fā)現了另外一個(gè)配體結合口袋2，該口袋中結合有游離的3-羥基脂肪酸，推測可能是反應中間體。 

　　綜合應用同位素標記、體外學(xué)表征、以及QM/MM計算模擬手段，研究人員驗證了RhlA在體外反應中具有硫酸酯酶活性，可以催化酰基-ACP（acyl carrier protein, 酰基載體蛋白）底物水解生成游離3-羥基脂肪酸。同時(shí)，團隊發(fā)現游離3-羥基脂肪酸也可以作為酰基受體，在RhlA酰基轉移酶活性的催化作用下與酰基-ACP供體形成HAA，但是該路徑在整體反應中的貢獻占比較小。 

　　研究人員進(jìn)一步應用半理性設計，針對兩個(gè)結合口袋中的13個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)構建了定點(diǎn)飽和突變文庫，應用高通量MALDI-TOF質(zhì)譜方法篩選了上千株突變株，最終得到了RhlA底物選擇性顯著(zhù)變化的9個(gè)突變體，并發(fā)現不同結合口袋的突變對于HAA中兩個(gè)脂肪鏈的長(cháng)度具有不同的調節作用。團隊對RhlA的三個(gè)典型突變體（Met37Phe、Phe43His和Ala101Met）開(kāi)展了重組表達、蛋白純化與體外酶動(dòng)力學(xué)分析，發(fā)現kcat是決定發(fā)酵液中不同RL同系物比例的關(guān)鍵參素。 

　　值得指出的是，盡管本研究解析了RhlA酶一個(gè)可能的反應路徑，但由于未獲得RhlA和酰基-ACP底物的共結晶結構，RhlA的催化機理仍有待進(jìn)一步闡明。  

　　該成果得到國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（2020YFA090023和2021YFA0910800）、國家自然科學(xué)基金（32071428）、廣東省基礎與應用基礎研究基金（2022A1515110680）、中科院戰略先導項目（XDB0480000）、深圳華大研究院開(kāi)發(fā)基金（BGIRSZ20210003）及深圳合成生物學(xué)創(chuàng )新研究院的支持。作者特別致謝上海同步輻射光源和深圳合成生物研究重大科技基礎設施對于X-射線(xiàn)晶體衍射和高通量質(zhì)譜篩選研究的幫助。