5月11日，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所馬英新課題組與湖北大學(xué)印文博士合作在Analytical Chemistry上發(fā)表了題為《Fluorescence and Colorimetric Analysis of African Swine Fever Virus Based on RPA-Assisted CRISPR/Cas12a Strategy》的補充封面論文。該論文首次構建了基于RPA-CRISPR/Cas12a系統的非洲豬瘟病毒（ASFV）比色-熒光雙模式檢測策略，通過(guò)構建新型磁珠-酶報告系統，結合RPA-CRISPR/Cas12a技術(shù)，實(shí)現了對ASFV基因的比色-熒光雙模式精準檢測。該方法能實(shí)現對單拷貝病毒基因組檢測，可用于便攜式可視化診斷，且在臨床樣本應用中展現了良好的檢測性能，為病毒感染的快速、精準診斷提供了有力工具。

文章上線(xiàn)截圖

上線(xiàn)鏈接：https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acs.analchem.3c01033

　　非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、出血性、高傳染性的豬疾病。迄今為止，仍然沒(méi)有廣泛有效的疫苗和治療方式用于應對非洲豬瘟，通常依靠快速診斷和撲殺感染豬等手段對疫情進(jìn)行有效控制。目前，對于非洲豬瘟的診斷主要依賴(lài)于PCR技術(shù)，該技術(shù)依賴(lài)于儀器設備和專(zhuān)業(yè)操作人員，只能在實(shí)驗室中進(jìn)行，無(wú)法滿(mǎn)足現場(chǎng)診斷的需求。等溫擴增技術(shù)，如重組酶聚合酶擴增（RPA）、滾環(huán)擴增（RCA）等，具有高效、簡(jiǎn)便易行等優(yōu)勢，但其靈敏度有限，難以單獨用于分子診斷。通過(guò)與CRISPR/Cas系統聯(lián)用，靈敏度顯著(zhù)提高，可增加分子診斷的準確性。然而，目前常用的單模式熒光檢測法或比色檢測法易受到環(huán)境干擾，造成檢測結果的不準確。 

　　本研究開(kāi)發(fā)了一種結合RPA、CRISPR/Cas12a和磁珠-酶新型報告系統，用于ASFV基因的快速精準診斷的方法。如圖1所示，biotin-ssDNA-azide與DBCO修飾的堿性磷酸酶（ALP）通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應合成biotin-ssDNA-ALP，biotin-ssDNA-ALP與鏈霉親和素修飾的磁珠（SA-MB）結合獲得MB-ssDNA-ALP報告系統。用RPA擴增ASFV基因序列，獲得擴增子，擴增子與Cas12a-crRNA復合物結合，激活Cas12a反式切割活性，切割MB-ssDNA-ALP上的ssDNA，釋放ALP；ALP催化pNPP水解生成pNP，引起比色信號變化，再加入量子點(diǎn)作為熒光報告子，實(shí)現比色和熒光的雙模式信號輸出。 

圖1 探針構建及ASFV檢測原理圖。biotin-ssDNA-azide與DBCO-ALP通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應獲得biotin-ssDNA-ALP，biotin-ssDNA-ALP與SA-MB偶聯(lián)獲得MB-ssDNA-ALP報告子。RPA擴增ASFV基因，擴增子激活Cas12a-crRNA復合物，Cas12a非特異性切割biotin-ssDNA-ALP報告子，釋放ALP；ALP水解pNPP，生成黃色pNP，加入藍色QDs后，在內濾效應作用下，藍色QDs熒光被猝滅。 

　　在該研究中，團隊首先合成、表征了biotin-ssDNA-ALP，并驗證了biotin-ssDNA-N3與DBCO修飾ALP的偶聯(lián)以及MB-ssDNA-ALP探針的合成。然后，考察了RPA擴增ASFV基因的能力。以高度保守的ASFV B646L基因為靶標，設計了三對RPA引物，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗驗證了三對引物都可高效擴增ASFV基因。接著(zhù)，驗證了CRISPR/Cas12a靶向剪切ASFV基因的能力。設計靶向三個(gè)RPA擴增子序列的crRNA，利用瓊脂糖凝膠電泳驗證了Cas12a被激活并切割RPA擴增子。最后，結合合成的MB-ssDNA-ALP探針、RPA-CRISPR/Cas12a系統以及藍色CdZnSe QDs，實(shí)現了對ASFV基因的比色-熒光雙模式精準檢測，靈敏度達20 copies/mL，可視化檢測104 copies/mL（圖 2A-2D）。磁分離技術(shù)的使用可有效降低背景信號，實(shí)現高信噪比檢測。對比發(fā)現本研究開(kāi)發(fā)的檢測方法靈敏度高于qPCR，且具有良好的特異性，探針不與其它豬疾病相關(guān)病毒產(chǎn)生交叉反應。同時(shí)，還探究了該方法在實(shí)際樣本中的檢測能力，對12份豬血真實(shí)樣本進(jìn)行了分析，結果顯示該檢測方法具有100%的準確度（圖2E和2F）。本方法結合熒光法的高靈敏度和比色法的易讀性，具有良好的靈敏度、便攜性和特異性，為病毒感染的快速、精準診斷提供了有效工具。

圖2 比色-熒光雙模式檢測ASFV基因。（A）不同濃度ASFV基因下，pNP的紫外光譜。（B）400 nm處吸光度與ASFV基因濃度的對數值之間的線(xiàn)性關(guān)系。（C）不同濃度ASFV基因下，CdZnSe QDs的熒光光譜。（D）熒光強度變化與ASFV基因濃度的對數值之間的線(xiàn)性關(guān)系。比色（E）和熒光（F）檢測方法用于臨床樣本的分析結果。可視化檢測結果均列于圖片上方。　　  

　　中科院深圳先進(jìn)院合成生物學(xué)研究所的毛國斌副研究員和中科院深圳先進(jìn)院與華中農業(yè)大學(xué)聯(lián)合培養碩士研究生羅杏為文章并列第一作者。中科院深圳先進(jìn)院合成生物學(xué)研究所的馬英新研究員、毛國斌副研究員和湖北大學(xué)印文博士為該論文的共同通訊作者。華中農業(yè)大學(xué)何進(jìn)教授、王璕副教授參與了該研究，復旦大學(xué)孔繼烈教授提供了樣本支持。該項目得到國家自然科學(xué)基金、科技部、中國科學(xué)院、廣東省、深圳市及深圳合成生物學(xué)創(chuàng )新研究院等多個(gè)項目的支持。 

補充封面（supplementary cover story）

超高靈敏CRISPR/Cas12a分子診斷傳感器構建用于非洲豬瘟病毒感染快速篩查　  

　　PI與課題組簡(jiǎn)介： 

　　馬英新博士，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院研究員，博士生導師，國家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年項目獲得者，國家重點(diǎn)研發(fā)計劃青年首席科學(xué)家，近5年主持1項國家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年項目、1項科技部重點(diǎn)研發(fā)計劃青年項目、1項國家自然科學(xué)基金青年項目、1項廣東省杰出青年基金項目、1項深圳市優(yōu)秀科技創(chuàng )新人才培養項目、1項中科院深圳先進(jìn)院優(yōu)青項目和1項博士后科學(xué)基金面上項目，并獲批了中國科學(xué)院青年創(chuàng )新促進(jìn)會(huì )、深圳市高層次人才、博士后創(chuàng )新人才支持計劃等人才計劃。 

　　以第一/通訊作者身份在J. Am. Chem. Soc.、Nat. Commun.、ACS Nano、Sci China Life Sci、Anal. Chem.、ACS Appl. Mater. Interfaces、Nano Res等國際著(zhù)名雜志發(fā)表論文30余篇。 

　　課題組長(cháng)期面向： 

　　1）有微生物學(xué)、噬菌體學(xué)、合成生物學(xué)、分子生物學(xué)、分析化學(xué)、生物醫學(xué)等學(xué)科研究背景者； 

　　2）有分子病毒學(xué)、噬菌體學(xué)、合成生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物傳感技術(shù)開(kāi)發(fā)等工作經(jīng)驗者； 

　　3）納米合成生物學(xué)等交叉學(xué)科背景的專(zhuān)業(yè)人才招聘博士后。 

　　有意申請者請將個(gè)人簡(jiǎn)歷（要求為PDF）以發(fā)送至：yx.ma1@siat.ac.cn，簡(jiǎn)歷及郵件標題注明“應聘崗位-學(xué)校名稱(chēng)-專(zhuān)業(yè)-姓名”。