近日，中國科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（LMB）研究員張長(zhǎng)生團(tuán)隊(duì)在多環(huán)大環(huán)內(nèi)酰胺類天然產(chǎn)物生物合成酶學(xué)機(jī)制研究方面取得新進(jìn)展。相關(guān)成果 “A Mechanistic Understanding of the Distinct Regio- and Chemoselectivity of Multifunctional P450s by Structural Comparison of IkaD and CftA Complexed with Common Substrates” 在線發(fā)表于Angewandte Chemie (《德國應(yīng)用化學(xué)》) 

　　惰性C-H鍵活化是合成高價(jià)值化合物的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，主要依靠過渡金屬催化，難以控制區(qū)域/立體/化學(xué)選擇性，一度被稱為有機(jī)化學(xué)中的“圣杯”。而在自然界中，少數(shù)細(xì)胞色素P450酶可以輕松有序地催化多步C-H鍵活化反應(yīng)，且具有高度的區(qū)域/立體/化學(xué)選擇性，是形成許多重要天然產(chǎn)物的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。這些P450酶被稱為多功能P450酶，是合成生物學(xué)應(yīng)用的重要酶元件，但由于解析的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)有限，酶控制多步反應(yīng)和精準(zhǔn)選擇性的酶學(xué)機(jī)制仍有待闡明。以ikarugamycin為代表的多環(huán)大環(huán)內(nèi)酰胺類天然產(chǎn)物(PoTeMs)是藥物先導(dǎo)化合物和生物農(nóng)藥的重要資源。在PoTeMs生物合成中，P450酶介導(dǎo)的后修飾極大豐富了化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性。有趣的是，其中的多功能P450酶IkaD和CftA被報(bào)道都天然識(shí)別ikarugamycin（1），但得到不同的氧化產(chǎn)物：IkaD先氧化C7=C8雙鍵形成環(huán)氧，再羥基化C29，獲得產(chǎn)物capsimycin G（1b）；而CftA先催化形成C29酮基，再微弱催化C30羥基化反應(yīng)獲得產(chǎn)物clifednamide C（1d）（圖1）。  

　　為了揭開P450酶IkaD和CftA催化功能差異的神秘面紗，研究團(tuán)隊(duì)首先解析了IkaD和CftA與共同底物1的復(fù)合結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)二者的整體三維骨架基本重合，是典型的金字塔形P450骨架，但參與構(gòu)成催化口袋的FG區(qū)域的構(gòu)象明顯不同，從而影響了催化口袋的形狀（圖1），使得同一個(gè)底物1朝向兩個(gè)酶血紅素鐵反應(yīng)中心的距離和角度不同（圖2），最終決定了酶催化反應(yīng)的區(qū)域和化學(xué)選擇性。基于這一發(fā)現(xiàn)，研究團(tuán)隊(duì)通過理性設(shè)計(jì)，對(duì)遠(yuǎn)離血紅素鐵反應(yīng)中心的極性氨基酸開展單點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)IkaD的部分突變酶能夠改變催化反應(yīng)的區(qū)域選擇性，形成天然分離未發(fā)現(xiàn)過的人工新產(chǎn)物。  

　　圖1. 多功能P450酶IkaD和CftA對(duì)相同底物的不同區(qū)域/化學(xué)選擇性及其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 

　　接著，研究團(tuán)隊(duì)以不同骨架的PoTeMs底物開展系統(tǒng)性的體外酶學(xué)測(cè)試，發(fā)現(xiàn)IkaD和CftA都能識(shí)別催化非天然底物，但與區(qū)域選擇性不同。分別解析IkaD和CftA與非天然底物的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（圖2），發(fā)現(xiàn)非天然底物并沒有誘導(dǎo)IkaD和CftA發(fā)生構(gòu)象變化，保持了二者FG區(qū)域的構(gòu)象差異，最終決定了對(duì)非天然底物的位點(diǎn)選擇性和反應(yīng)順序。有趣的是，遠(yuǎn)離血紅素鐵反應(yīng)中心的極性氨基酸突變也顯著改變了IkaD對(duì)非天然底物催化反應(yīng)的區(qū)域選擇性。 

　　圖2. P450酶與不同骨架的PoTeMs底物在IkaD和CftA晶體結(jié)構(gòu)中的結(jié)合模式 

　　雖然參與組成P450酶催化口袋的BC和FG區(qū)域存在構(gòu)象變化的現(xiàn)象已經(jīng)廣為人知，本研究首次發(fā)現(xiàn)了FG區(qū)域的構(gòu)象差異導(dǎo)致同一底物1在IkaD和CftA催化口袋中以不同的姿勢(shì)朝向酶反應(yīng)中心，造成了二者催化反應(yīng)的區(qū)域選擇性和化學(xué)選擇性不同。這些發(fā)現(xiàn)為多功能P450酶如何控制位點(diǎn)選擇性、反應(yīng)順序和反應(yīng)類型提供了蛋白三維晶體結(jié)構(gòu)方面的解答，并為P450酶理性改造提供了參考，對(duì)于認(rèn)知海洋天然產(chǎn)物生物合成途徑和豐富海洋微生物酶元件庫具有重要的科學(xué)意義。  

　　博士研究生蔣鵬和博士后金紅波為論文的第一作者，研究員張長(zhǎng)生和副研究員張麗萍為共同通訊作者。以上研究工作得到了國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目、廣東省自然科學(xué)基金、廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目和海南省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目等的資助。  

　　相關(guān)論文信息：Peng Jiang#, Hongbo Jin#, Guangtao Zhang, Wenjun Zhang, Wei Liu, Yiguang Zhu, Changsheng Zhang*, Liping Zhang*, A Mechanistic Understanding of the Distinct Regio- and Chemoselectivity of Multifunctional P450s by Structural Comparison of IkaD and CftA Complexed with Common Substrates, Angewandte Chemie, doi.org/10.1002/anie.202310728 

　　文章鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202310728