近日，中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（LMB）閆巖研究員團(tuán)隊(duì)在真菌直線型四環(huán)混源萜ochraceopones的生物合成與酶反應(yīng)機(jī)制研究方面取得新進(jìn)展，相關(guān)成果“An Enzymatic Carbon-Carbon Bond Cleavage and Aldol Reaction Cascade Converts an Angular Scaffold into the Linear Tetracyclic Core of Ochraceopones”在線發(fā)表于Angewandte Chemie International Edition（《德國(guó)應(yīng)用化學(xué)》）。助理研究員李艷芹、碩士叢夢(mèng)靜為共同第一作者，研究員閆巖、王俊鋒與張長(zhǎng)生為共同通訊作者。

混源萜（meroterpenoids）是一類(lèi)部分分子骨架來(lái)源于萜烯的天然產(chǎn)物，它們具有復(fù)雜多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)及廣泛的生物學(xué)活性。這些豐富的骨架結(jié)構(gòu)既可能來(lái)源于萜烯部分多樣化的重排與環(huán)化，也可能來(lái)源于其非萜烯部分如聚酮、吲哚、莽草酸等豐富的后修飾。因此其生物合成途徑中可能蘊(yùn)含了大量新穎的酶促化學(xué)反應(yīng)機(jī)制，深入研究這些酶學(xué)機(jī)制將為我們創(chuàng)建具有新型骨架結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性的藥物先導(dǎo)提供基礎(chǔ)。真菌直線型四環(huán)混源萜ochraceopones具有優(yōu)異的抗病毒和抗炎活性，然而其由常見(jiàn)的四元折線型結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為獨(dú)特的直線型結(jié)構(gòu)所涉及的化學(xué)合成和酶學(xué)反應(yīng)機(jī)制卻極具挑戰(zhàn)性。

研究團(tuán)隊(duì)早期從一株南極土壤來(lái)源真菌Aspergillus ochraceopetaliformis?SCSIO 05702中分離得到了一類(lèi)四環(huán)混源萜類(lèi)化合物ochraceopones（化合物1-4，7）（J Nat Prod, 2016,79:59-65）。基于基因組學(xué)及生物信息學(xué)分析定位了負(fù)責(zé)該類(lèi)化合物生物合成的基因簇（圖1），通過(guò)構(gòu)建構(gòu)巢曲霉異源表達(dá)體系，聯(lián)合體外微粒體實(shí)驗(yàn)及蛋白表達(dá)，成功鑒定和表征了負(fù)責(zé)化合物ochraceopones形成的所有生物合成酶，并闡明了完整的生物合成途徑（圖2）。

圖1. 直線型四環(huán)混源萜ochraceopones的生物合成基因簇

圖2. 直線型四環(huán)混源萜ochraceopones的生物合成途徑推測(cè)

在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)證明了ochraceopones的線性四環(huán)骨架是由同一個(gè)折線型前體即ochraceopone E（7）衍生而來(lái)。通過(guò)體外氘水標(biāo)記的微粒體實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了化合物7生成16涉及的碳-碳鍵斷裂反應(yīng)不是自發(fā)進(jìn)行的，而是由多功能細(xì)胞色素P450-OchH催化完成。其通過(guò)將C13位羥基形成氧自由后促發(fā)C13-C14鍵斷裂，而后通過(guò)羥基化形成十元環(huán)的中間體18，之后自發(fā)形成化合物16（圖3）。

圖3. OchH的功能表征

為了驗(yàn)證16作為真實(shí)底物的正確性，研究團(tuán)隊(duì)將16與基因簇內(nèi)其余后修飾基因在構(gòu)巢曲霉中進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化，并通過(guò)體外微粒體與蛋白的聯(lián)合反應(yīng)證實(shí)了該反應(yīng)過(guò)程。結(jié)果顯示，異構(gòu)酶OchL通過(guò)催化分子內(nèi)的羥醛反應(yīng)將經(jīng)過(guò)多步修飾的碳-碳鍵斷裂形成的十元環(huán)重新連接，形成了一個(gè)新的碳-碳鍵而呈現(xiàn)出最終的線性四環(huán)化合物3（圖4）。

圖4. 三環(huán)到線性四環(huán)骨架ochraceopones的生物轉(zhuǎn)化表征

然而，在異源表達(dá)及體外反應(yīng)過(guò)程中，除了獲得一系列不能被繼續(xù)轉(zhuǎn)化的途徑副產(chǎn)物如化合物19、19’、21和23之外，均沒(méi)有檢測(cè)到反應(yīng)的真正中間體（圖4）。但是就觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在目前的生物反應(yīng)體系中，隨著氧化后修飾的多步積累，反應(yīng)的真實(shí)底物在缺乏其后續(xù)生物轉(zhuǎn)化酶的條件下無(wú)法穩(wěn)定存在。肯定的是，根據(jù)分離到的一系列副產(chǎn)物及對(duì)其形成機(jī)制的推測(cè)，可以確定整個(gè)反應(yīng)中間過(guò)程存在的真實(shí)性。

總之，本研究鑒定并表征了合成ochraceopones的所有生物合成酶，并證明了完整的生物合成途徑。證實(shí)了ochraceopones類(lèi)化合物是由OchHJGL催化的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)將常見(jiàn)的折線型四環(huán)前體合成獨(dú)特線性四環(huán)骨架結(jié)構(gòu)。其中，多功能細(xì)胞色素P450-OchH負(fù)責(zé)催化自由基形成并引發(fā)C-C鍵斷裂和隨后的C12的羥基化，然后OchJ催化C15羥基化和OchG催化C15-OH脫氫。最后，醛縮酶OchL通過(guò)催化分子內(nèi)羥醛反應(yīng)導(dǎo)致新的C-C鍵形成而構(gòu)建最終的線性四環(huán)骨架。OchH和OchL的發(fā)現(xiàn)及其功能闡明將為尋找更多新的P450酶和醛縮酶提供途徑。然而，由于OchL底物的不穩(wěn)定性，可能需要通過(guò)合成更穩(wěn)定的底物衍生物來(lái)進(jìn)一步研究其催化機(jī)理。

上述研究工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、海南省科技計(jì)劃三亞崖州灣科技城科技創(chuàng)新聯(lián)合項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)科學(xué)院王寬誠(chéng)率先人才計(jì)劃“盧嘉錫國(guó)際團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目”和海南省自然科學(xué)基金等的資助。

相關(guān)論文信息：Yanqin Li， Mengjing Cong，Wengui Wang, Xiufeng Zhang, Yiguang Zhu, Yongxiang Song, Wenjun Zhang, Hua Xiao, Yonghong Liu, Changsheng Zhang, Junfeng Wang, and Yan Yan. An Enzymatic Carbon-Carbon Bond Cleavage and Aldol Reaction?Cascade Converts an Angular Scaffold into the Linear Tetracyclic Core of Ochraceopones. Angew Chem Int Edit,2024. doi.org/10.1002/anie.202403365

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